一、實驗目的 

1. 了解凝膠層析的原理及其應用。 

2. 掌握利用凝膠層析法分離純化蛋白質的實驗技能 二、實驗原理 

凝膠層析又稱凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖液洗脫。大分子不能進入凝膠顆粒中的靜止相中，只留在凝膠顆粒之間的流動相中，因此以較快的速度shou先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，并很快在流動相和靜止相之間形成動態平衡，因此就要花費較長的時間流經柱床，從而使不同大小的分子得以分離。 

凝膠過濾柱層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即： 

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 

在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。 

Ve（洗脫體積）為某一成分從加入樣品算起，到組分的**大濃度（峰）出現時所流出的體積。Ve隨溶質的相對分子質量的大小和對凝膠的吸附等因素而不同。一般相對分子質量較小的溶質，它的Ve值比相對分子量較大的溶質要大。通常選用藍色葡聚糖2000作為測定外水體積的物質。該物質分子量大（為200萬），呈藍色，它在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。但是，在測定激酶等蛋白質的分子量時，不宜用藍色葡聚糖2000測定外水體積，因為它對激酶有吸附作用，所以有時用巨球蛋白代替。Vo為層析柱內凝膠顆粒之間隙的總容積，稱外水體積。Vi為層析柱內凝膠內部微孔的總容積，稱內水體積，Vi=Vt-Vo。測定內水體積（Vi）的物質，可選用硫酸銨、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它與凝膠無吸附力的小分子物質。 

Kav是判斷分離效果的一個重要參數。當某種成分的Kav=0時，意味著這一成分完全被排阻于凝膠顆粒的微孔之外而**先被洗脫出來，即Ve=Vo。當某種成分的Kav=1時，意味著這一成分完全不被排阻，它可以自由地擴散進入凝膠顆粒內部的微孔中，而**后被洗脫出來，即Ve=Vt。介于兩者分子量之間的物質，其0﹤Kav﹤1，在中間位置被洗脫。可見，Kav的大小順序決定了被分離物質流出層析柱的順序。 

本實驗采用葡聚糖凝膠G－75作固相載體，可分離分子量范圍在2000～70000之間的多肽與蛋白質。上樣樣品為牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。當混合液流經層析柱時，兩種物質因Kav值不同而被分離。 三、儀器與試劑 

1.器材：層析柱、恒流泵、自動部分收集器、紫外檢測器、記錄儀、量筒、燒杯、試管、吸管、玻璃棒等。 2.試劑 

  （1）標準蛋白 

      a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）       b.溶菌酶：Mw =14,300   （2）洗脫液：0.9% NaCl溶液 （3）藍色葡聚糖－2000、葡聚糖凝膠Sephadex G-75。 四、實驗內容 

（一）凝膠的前處理（已做好） 

將Sephadex G-75置燒杯中，加入洗脫液于室溫溶脹2～3天，反復傾瀉去掉細顆粒，然后減壓抽氣去除凝膠孔隙中的空氣，沸水浴中煮沸2～3小時（可去除顆粒內部的空氣及滅菌）。在凝膠溶脹時避免劇烈攪拌，以防凝膠交聯結構的破壞。 （二）裝柱（已做好） 

取潔凈的的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。在柱中注入洗脫液（約1/3柱床高度），將凝膠濃漿液緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1～2cm 高度后打開出水口，使凝膠沉降，并不斷加入凝膠濃漿。注意裝柱過程中注意凝膠不能分層。 （三）平衡 

裝柱完成后，接上恒流泵，以0.9%的氯化鈉為流動相，以0.75ml/min(Φ1.6cm柱)或0.5ml/min(Φ1.0cm柱)的速度開始洗脫，用1～2倍床體積的洗脫液平衡，使柱床穩定。（實驗中平衡1hr） 

（四）凝膠柱總體積（Vt）的測定。 

平衡完畢后，測定凝膠柱床的高度，計算柱床總體積Vt（凝膠柱直徑為1 cm或1.6cm）。 （五）V0的測定 打開出水口，使殘余液體降** 與膠面相切（但不要干膠），關閉出水口。用細滴管吸取0.2ml（4mg/ml）藍色葡聚糖-2000，小心地繞柱壁一圈（距膠面2mm）緩慢加入，打開出水口（開始收集！），等溶液滲入膠床后，關閉出水口，用少許洗脫液沖洗2次，待滲入膠床后，再在柱上端加滿洗脫液，開始洗脫，作出洗脫曲線。收集并量出從加樣開始**洗脫液中藍色葡聚糖濃度**高點（肉眼觀察）的洗脫液體積即為V0。 

藍色葡聚糖洗下來之后，還要用洗脫液繼續平衡１～２倍床體積（實驗中平衡1hr），以備下步實驗使用。 （六）上樣、洗脫  

將柱中多余的液體放出，使液面剛好蓋過凝膠，關閉出口。用移液管吸取0.5mL蛋白質混合液小心地加到凝膠床上，打開出水口，待樣品完全進入凝膠后，加少量洗脫液沖洗柱內壁2次，待液體完全流進床內后，關閉出水口。在柱上端加滿洗脫液，打開恒流泵，開始洗脫收集，6min一管。用紫外分光光度計測定各管收集液的OD280值，以洗脫體積為橫坐標，OD值為縱坐標繪出洗脫曲線。 （七）凝膠柱的處理（不做） #p#分頁標題#e#

一般凝膠柱用過后，反復用蒸餾水（2～3倍床體積）通過柱即可。如若凝膠有顏色或比較臟，需用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl洗滌，再用蒸餾水洗。冬季一般放2個月無長霉情況，但在夏季如果不用，需要加0.02%的疊氮化鈉防腐。 五、結果與討論 1. 繪制洗脫曲線。 

以洗脫體積為橫坐標、OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出洗脫曲線。并標出各成分的Ve值。 2. 計算各成分的Kav值。