一、實驗目的和內容
目的：1. 掌握凝膠過濾層析的原理，掌握凝膠柱柱效測定方法； 2. 熟悉凝膠層析的一般過程；
3. 了解凝膠介質的選擇原則和應用*域。 內容：1. Sephadex G-50凝膠柱的裝填； 2. 凝膠柱柱效測定； 3．凝膠再生的方法。
二、實驗儀器和試劑 1. 實驗儀器
層析柱（1×40 cm），砝碼天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白質檢測儀，記錄儀，滴頭吸管
2. 實驗材料和試劑
Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS緩沖液，5％丙酮（PBS緩沖液作為溶劑）
三、實驗步驟 清洗層析柱
測定層析柱的內徑、高度，計算所需凝膠的體積
根據Sephadex G-50的膨脹體積，計算所需干凝膠的質量
稱取相應質量的干凝膠，加入其總吸液量10倍的0.02 mol/L PBS 在100℃水浴中加熱溶脹1小時以上，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去 用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出 關閉層析柱出水口，向柱管內加入約1/4柱容積的洗脫液 （重復使用的填料，從此步開始）
邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續傾入柱中，使其自然沉降
等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱的出口，調節合適的流速，使凝膠繼續沉積 待沉積的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關閉出水口 通過2-3倍柱床體積的洗脫液使柱床穩定(流速0.5～1 mL/min) 始終保護凝膠上端有一段液體
打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直**與膠面相切 沿管壁將5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝膠床面上，應避免 將床面凝膠沖起 （參考完成時間11：30）
打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內，同時收集流出液，當樣品溶液流**與膠面相切時，夾緊下口夾子
按加樣操作，用1 mL洗脫液沖洗管壁2次
加入3－4 mL洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽 將層析柱進水口連通
恒流泵，柱出水口與核酸蛋白質檢測儀比色池進液口相連，比色池出液口再與自動
部分收集器相連，用兩根導線將檢測儀與記錄儀連接起來，設置好基線的位置
洗脫時，打開上、下進出口夾子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脫，記錄tr(記錄儀紙速設為12cm/h，電壓200mv；核酸蛋白監測儀檢測波長254nm，靈敏度為0.1A)， 計算單位高度的柱效 （參考完成時間16：00）柱效計算公式：N = 5.54•［θr/( W 1/2)］2
其中，θr為平均洗脫時間，W 1/2為半峰寬。均為無因次特性值，測量時精確到1mm。 [Sephadex G-100每米理論塔板數為3000～6000]
四、注意事項
1. 各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。
2. 裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，**好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠。
3. 始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分蒸發，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動。
4. 所用凝膠比較昂貴，需小心操作，實驗后回收，盡量避免浪費和損失。
五、演示
1. 在儀器使用前，shou先檢查檢測器，電源和記錄儀三部份電路連接是否正確，插上電源插頭。
2. 接通記錄儀電源開關，使電源開關拔到“通”指示燈亮。可根據需要調換不同的走紙速度。記錄儀量程調在10mV檔上。
3. 將檢測儀波長旋鈕旋到所需波長刻度上，把量程旋鈕拔到100％T檔。
4. 按下檢測儀電源箱面板上的電源開關，此時記錄儀指針從零點開始向右移動某一刻度，調節“光量”旋鈕使指針停留在記錄儀大約中間位置5mV左右數字顯示為50左右。儀器開機穩定時間大約在1小時左右，待基線平直后，可加樣測試。
5. 把檢測器進樣口塑料膠管接到
部份收集器上，使層析柱中的洗脫液通過。透光率為“0”廠家巳調好，光密度A要調零，量程開關拔到100％T，調節光量旋鈕，使記錄儀指針在10mV數字顯示為100，即透光率為100%。把量程開關拔到“A”擋，緩慢調節A調零旋鈕，使檢測儀數字顯示為“0” ， 同時調節記錄儀零位旋紐使記錄儀指示在"0"位 。
6. 上述5個步驟結束后，就可以在層析柱上加樣。當樣品經層析柱分離，通過檢測后，就能通過記錄儀給出所需樣品吸收的圖譜。
7. 測試完畢，必須切斷電源，并用蒸餾水清洗樣品池和尼龍管。
記錄儀光吸收A讀數
當采用l0mV量程記錄儀時，記錄儀的滿量程讀數對應于A量程開關所對應的A讀數范圍。如A量程開關選定在0-0.**時，則記錄儀滿量程光吸收A讀數為0.5，當記錄筆指示在記錄紙一半 (50%刻度)位置時即為0.2**。
數字顯示光吸收A讀數(可變量程讀數模式)
當A量程開關選定在0-1.0A檔時，此時數顯板上顯示和讀數即為光吸收A的實際讀數，如顯示為080即表示為0.80A。
當A量程開關切換在其它量程位置時，則數顯光吸收A讀數為: A量程選定在0-2.0檔時，數顯讀數×2=實際光吸收讀數A A量程選定在0-1.0檔肘，數顯讀數×1=實際光吸收讀數A #p#分頁標題#e#
1.將“手/自”框內的鍵置于自動狀態，按“定”和“停”;使定時時間為零，放開“停”按“快”或“慢”(“定”仍按著)**所需的定時時間，放開"慢"和“定”，再按一下"停"設定定時時間工作就完畢。若要查看設置時間，則只需按一下“定”鍵，就能顯示上一次所設時間，若要以秒顯示走時時刻，則需按下“秒”鍵。
2.定位，將“順/逆”鍵置于“順”或“逆”狀態，按“手動”鍵，使試管架轉**終點，這時報警器工作，報警指示燈亮，然后將“順/逆”鍵置于“逆”或 “順”狀態，本儀器就會自動地對準**個試管(在 “順”狀態，**臂試臂為**外的那根。在“逆”狀態，**臂試管為**內的那根)。如滴管口沒對準**根試管只要松開換節臂調整螺釘，使滴臂口對準**根試管即可。
七、背景資料
凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。相對分子質量大的生物分子由于不能進入或不能完全進入凝膠內部的網孔，沿著凝膠顆粒間的空隙或大的網狀孔通過，大分子相對于小分子遷移的路徑短，保留值小，所以在層析過程中遷移速度**快，先從柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后從柱中流出。
凝膠層析常用于分離純化蛋白質（包括酶類）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于樣品的濃縮和脫鹽及測定生物大分子的分子質量等方面。以下對凝膠層析的使用進行具體介紹。
圖1 凝膠層析的原理
（一） 層析柱
層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管,柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多采用 20 -30cm 長的層析柱，分級分離時，一般需要 100cm 左右長的層析柱，其直徑在 1 -5cm 范圍內，小于 1cm 產生管壁效應，大于 5cm 則稀釋現象嚴重。
由于層析柱的直徑大小不影響分離度，所以樣品量大時可用大直徑的層析柱 (一般制備用凝膠柱，直徑大于 2cm , 但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上 ) 。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過 1m。 ⑴ 分組分離時用短柱，一般凝膠柱長 20－30cm ，柱高與直徑的比較 5:1─10:1 ，樣品溶液體積應小于 凝膠床體積為的 20% 。 ⑵ 分級分離時柱高與直徑之線為 20:1─100:1 （層析柱濾板下的死體積應盡可能的小，如果支撐濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的 1/1000 ），樣品溶液體積 應小于 凝膠床體積為的 5 % 。 ⑶ 脫鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。適用的凝膠為 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱長與直徑之比為 5-15 ，樣品體積可達柱床體積的 20 — 25 % ，為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發性鹽類。
（二）凝膠的類型
（三）凝膠的選擇
根據所需凝膠體積，估計所需干膠的量。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的 2 倍，例如 Sephadex G-200 的吸水量為 20 ， 1 克 Sephadex G─200 吸水后形成的凝膠體積約 40mL 。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質采用 100-200 號篩目的的 Sephadex G-200 效果好； 脫鹽用 Sephadex G-25 、 G-50 ，用粗粒，短柱，流速快。
（四）凝膠的制備
商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫**近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在 1-2 小時內即可完成。特別是在使用軟膠時， 自然膨脹需 24 小時**數天，而用加熱法在幾小時內就可完成。這種方法不但節約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細菌和排除膠內的空氣。
（五）樣品溶液的處理
樣品溶液如有沉淀應過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過 Sephadex G-15 短柱除去。樣品的粘度不能太大，否則影響分離效果。上柱樣品液的體積根據凝膠床體積的分離要求確定。
（六）防止微生物的污染
交聯葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有： #p#分頁標題#e#
（1）疊氨鈉（ NaN3） 在凝膠層析中只要用 0.02 ％疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶于水，在 20 ℃ 時約為 40 %。它不與蛋白質或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質和碳水化合物的層析特性，但可干擾熒光標記蛋白質。 （2）可樂酮 [Cl 3C-C(OH)(CH3)2 ] 在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02 % 。在微酸性溶液中它的殺菌效果**佳，在強堿性溶液中或溫度高于 60℃ 時易引起分解而失效。
（3）乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為 0.05-0. 01 %。在微酸性溶液中**為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質結合，因而包含疏基的蛋白質可在不同程度上降低它的抑菌效果。
（4）苯基汞代鹽 在凝膠層析中使用濃度為 0.001%-0.01 %。在微堿性溶液中抑效果**佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質亦可降低或抑制它的抑菌作用。
除了直接加入抑菌劑，在位消毒 （Sanitization-in-place, SIP）和在位清（Cleaning-in-place，CIP）對層析介質和儀器的保養十分重要。SIP的目的是將微生物感染減到**低，jue大多數的微生物可用0.5-1M NaOH以該凝膠的建議流速洗約0.5-1小時消除。CIP的目的是去除柱床內沉淀的及頑固殘留的蛋白。凝膠在使用十次以后，**少做一次CIP。事實上，做CIP 時，往往已經包含了SIP，不必再重復。新一代Bioprocess凝膠由于擁有很高的化學穩定性，大都可用**1-2M NaOH在位清洗。BioProcess離子交換、疏水層析介質以40cm/h, 用0.5-2M NaOH相反方向洗四個體積，再以**少3cv平衡緩沖液再生。凝膠過濾介質CIP 的方法相同。但流速需減**20cm/h，接觸**少一**二小時。SOURCE介質用二**五個柱體積1M NaCl、1M NaOH、1M HCl、1M NaCl 的順序以180cm/h 洗柱。每個溶液間需用二個柱體積蒸餾水過柱。去除脂類及疏水性強的蛋白, 使用遞增式梯度以4~10cv 70%乙醇或30%異丙醇洗柱，再用**少3cv蒸餾水加以過柱。或用2cv 0.5% 非離子性去污劑 [溶在1M乙酸中] 洗柱，再用五個柱體積70% 乙醇過過柱，**后用3～4cv蒸餾水加以清洗。
（六）凝膠回收
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用 70％、90％、95％乙醇脫水平衡**乙醇濃度達 90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
參考文獻
[1] **璞，林紅,朱濱.凝膠過濾層析實驗中Sephadex的溶脹與回收保存.實驗技術與管理,2006,23 (2):24-25.
