摘要：本實驗利用凝膠過濾的特點，先向?qū)游鲋屑尤隖eSO4 溶液，形成一個還原帶，然后加入血紅蛋白樣品（血紅蛋白與高鐵氰化鉀的混合液）。由于血紅蛋白分子量大，在凝膠床中流速快，當其流經(jīng)還原帶時，褐色的高鐵血紅蛋白立即變?yōu)樽霞t色的亞鐵血紅蛋白。亞鐵血紅蛋白繼續(xù)下移，與緩沖液溶解的O2 結(jié)合，形成鮮紅色的氧合血紅蛋白。鐵氰化鉀是小分子量化合物，呈黃色帶遠遠地落在后邊。這樣，就可以形象直觀地觀察到凝膠過濾的分離效果。 關(guān)鍵詞:凝膠柱，抗凝血，磷酸緩沖溶液
凝膠過濾是一種利用凝膠按照分子大小分離物質(zhì)的層析方法，又稱分子篩層析或排阻層析。目前常用于凝膠過濾的的凝膠類介質(zhì)主要有4大類，即葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠等層析介質(zhì)。它們都是不溶于水的高聚物，內(nèi)部有很微細的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以Sephadex為例，它是由一定平均分子量的葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)生成的高聚物，網(wǎng)眼的大小由葡聚糖的分子量與環(huán)氧氯丙烷的用量來控制。葡聚糖的分子量越大、環(huán)氧氯丙烷用量越大，則交聯(lián)度越大，凝膠的網(wǎng)眼越小。Sephadex有很強的親水性，在水或緩沖液中能吸水膨脹。交聯(lián)度越大，網(wǎng)眼越小，吸水量也越少。本實驗利用Sephadex將血紅蛋白從雞血中進行分離，通過層析柱可以形象的看見分離的過程。 1、實驗材料及試驗方法
1.1實驗儀器：燒杯、移液管、膠頭滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、PH試紙、電子天平、層析柱、洗耳球、鐵架臺、鑰匙、稱量紙 1.2實驗試劑
（1）磷酸緩沖液（PH 7.0）：稱取Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g，溶于蒸餾水中，定容**1000mL。
（2）Na2HPO4－EDTA－Na2 溶液：稱取2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸餾水溶解并定容**100mL。
（3）40m mol/L FeSO4 溶液:稱取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL水中（用時現(xiàn)配）。
（4）Sephadex G－25，或G-75 （5）固體鐵氰化鉀〔K3Fe（CN）6〕
（6）抗凝血（哺乳動物血樣，以1：6的比例加入2.5%檸檬酸鈉，置于4℃冰箱中保存）。 1.3實驗方法
（1）凝膠溶脹（該步驟有老師在實驗前準備）
（2）裝柱：將層析柱垂直固定，旋緊柱下端的螺旋夾，在柱內(nèi)加入少量磷酸緩沖液或直接把處理好的凝膠連同適當體積的緩沖液用玻棒攪勻，然后邊攪拌邊倒入層析柱中，同時開啟螺旋夾，控制一定流速。**好連續(xù)裝完凝膠，若分次裝入，需用玻棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面影響分離效果。裝柱后形成的凝膠床**少長30cm，使膠床表面保持2-3cm液層。
注意：整個操作過程中凝膠必須處于溶液中，不得暴露于空氣，否則將出現(xiàn)氣泡和斷層，應當重新裝住。
（3）平衡：繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調(diào)整緩沖液流速，平衡20-30分鐘。
（4）樣品制備：
①取1ml雞的抗凝血放入小燒杯中，加5ml pH7.0 的磷酸緩沖液，再加入27.5mg K3Fe(CN)6 固體，用玻棒攪動使其溶解，即得褐色的高鐵血紅蛋白溶液。
②吸取 1ml FeSO4 溶液和 1ml EDTA-Na2-NaHPO4 溶液，于小燒杯中混勻。（注意：還原劑混合液要新鮮配制，盡可能縮短其與空氣接觸的時間）。
（5）上樣：旋開層析柱上端旋扭，待膠床上部的緩沖液幾乎全部進入凝膠（即緩沖液液面與膠床平面相切）時，立即加入0.4ml上述混合液，待其進入膠床表面僅留約1mm液層時，加入0.5ml緩沖液，再當膠床表面僅留約1mm液層時，吸取0.5ml血紅蛋白樣品溶液，小心地注入層析柱膠床面中央，注意切勿沖動膠床。慢慢打開螺旋夾，待大部分樣品進入膠床、床面上僅有1mm 液層時，用乳頭滴管加入少量緩沖液，使剩余樣品進入膠床，然后用液管小心加入3～5cm 高的洗脫緩沖液。
6．洗脫：繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調(diào)整流速，使上下流速同步保持每分鐘約6滴。
7．凝膠的回收：實驗完畢用洗脫液把柱內(nèi)有色物質(zhì)洗脫干凈，保留凝膠柱重復使用或回收凝膠。 2、實驗結(jié)果與分析
從實驗過程可以清楚滴看見凝膠過濾的分離效果。當裝柱完成后，shou先加入的是磷酸緩沖液，洗脫一定時間后，再加入FeSO4 溶液和EDTA-Na2-NaHPO4 溶液的混合液;此時凝膠柱內(nèi)會有一段黃色帶，當此黃色帶再磷酸緩沖液的洗脫下完全進入凝膠柱內(nèi)后，再加入的是血紅蛋白樣液，這時可以看見之前的黃色帶上面是緊跟著的是紅色條帶;再當此紅色條帶完全進入凝膠柱內(nèi)后，繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，可以看見，紅色條帶會慢慢下移，然后與黃色條帶重合，之后再超過黃色條帶，以較快速度繼續(xù)向下移動，整個過程可以清楚的看見紅黃兩個明顯的條帶。**后，紅色條帶會先于黃色條帶被洗脫出來。將洗脫出來的紅色洗脫液與之前配制的高鐵血紅蛋白（稀釋10倍）分別進行掃描，得到的曲線如下：
②此為高鐵血紅蛋白稀釋10倍后掃描所得曲線 3、討論
現(xiàn)將具體分析實驗現(xiàn)象。本實驗利用凝膠過濾的特點，當加入FeSO4 溶液和EDTA-Na2-NaHPO4 溶液的混合液時，shou先形成的是一個還原帶，加入血紅蛋白樣液（此樣液即是血紅蛋白與高鐵氰化鉀的混合液）后，由于血紅蛋白分子量大，在凝膠床中流速快，當其流經(jīng)還原帶時，褐色的高鐵血紅蛋白立即變?yōu)樽仙膩嗚F血紅蛋白，亞鐵血紅蛋白繼續(xù)下移，與緩沖液中溶解的氧結(jié)合，形成鮮紅的氧合血紅蛋白，而鐵氰化鉀分子量小，呈黃色帶遠遠地落在了后面。試驗過程中紅色帶在穿越黃色帶的前后顏色變化并不明顯，但還是可以明顯的將黃色帶與紅色帶區(qū)分開來。#p#分頁標題#e#
