1、研究意義與前景   

 層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。【1】  

紙層析法（paper chromatography）是生物化學(xué)上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機(jī)酸、維生素、抗菌素等物質(zhì)的一種分離分析工具。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機(jī)溶溶劑是流動相。【2】 

 

分配層析法 分配色譜系色譜法之一種，利用固定相與流動相之間對待分離組分溶解度的差異來實(shí)現(xiàn)分離。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔(dān)體表面。分配色譜過程本質(zhì)上是組分分子在固定相和流動相之間不斷達(dá)到溶解平衡的過程。【3】 

 

2、實(shí)驗?zāi)康?nbsp;

     （1）掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)（包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量） 

     （2）學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。  

3、實(shí)驗原理 

      層析法也稱色譜法，是1906年俄*植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。 后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。 1944年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。 層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。按層析過程的機(jī)理分類： 

 吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。  分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。  離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。  

凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同   

紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，它是利用不同的氨基酸在展層溶劑中的分配系數(shù)不同而得以分離的一種方法。惰性支持物是新華一號濾紙，其上含有很多的羥基，與水有較強(qiáng)的親和力因此把它看成是含有靜止水相的惰性支持物。水相因此稱為靜止相（固定相），有機(jī)溶劑稱為流動相。展層溶劑由兩個互不相溶的有機(jī)溶劑和水組成，它們互相混合時便分成兩相：一相是以水飽和了的有機(jī)相，另一相是以有機(jī)溶劑飽和了的水相。  

分配系數(shù)(α)＝溶質(zhì)在固定相的濃度(CS)/溶質(zhì)在流動相的濃度(CL)   

當(dāng)用濾紙進(jìn)行分配層析時,流動相流經(jīng)支持物時與固定相之間連續(xù)抽提，使氨基酸在兩相之間不斷分配而得以分離。分配層析的原理可用一個模式解釋（英*Martin等）：把濾紙看成是一個層析柱，可以分成若干層板，設(shè)層板的物質(zhì)為A、B；且A和B的分配系數(shù)（α）分別為1和1/3；又設(shè)固定相為S，流動相為L，兩相互相接觸但不相混溶。當(dāng)**層流動相中加入一定量的A、B兩項物質(zhì)后，溶質(zhì)根據(jù)各自的分配系數(shù)在**層的兩相中分配，流動相繼續(xù)在流動，此時**層固定相與新流到的流動相之間以及原來**層流動相與第二層固 定相之間進(jìn)行第二次分配，以此類推三次分配即可看出A與B**濃部分以分開，A在第二層**濃，B在第三層**濃，如果繼續(xù)抽提下去，經(jīng)過若干此后，A、兩物質(zhì)便可完全分開。顯然，分配系數(shù)越大的,則越易分開。  

物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移值）來表示的：        

 Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離 

 

在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)；層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗利用紙層析法分離氨基酸。 

 

無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法或顯色法鑒定。本實(shí)驗采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應(yīng)受溫度、 ph、時間影響較大。如果要使結(jié)果重復(fù)，必須嚴(yán)格控制上述條件。 

  

二、實(shí)驗材料與方法 

1、實(shí)驗試劑 

1. 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml） 

     四種氨基酸是甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、混合氨酸分別配置成一定濃度的溶液 2. 80%甲酸3. 0.5%茚三酮溶液 4. 氨基酸混合液 5. 正丁醇 

2、實(shí)驗器材 

1. 新華濾紙 2. 培養(yǎng)皿 

3. 電熱鼓風(fēng)干燥箱 4. 點(diǎn)樣管及點(diǎn)樣架 5. 針、線、尺 6. 燒杯 7. 鐘罩 #p#分頁標(biāo)題#e#

 

3、實(shí)驗操作 

（一）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析      1、單向上行層析 

     （1）氨基酸Rf值的測定  A、 濾紙：選用*產(chǎn)新華1號濾紙，28cmX28cm，在距紙邊2cm處，用鉛筆輕輕劃一條線，

于線上每隔3cm處畫一小圓圈作為點(diǎn)樣處，圈直徑不超過0.5cm。 

B、 點(diǎn)樣：點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長，以致分離不清，氨基酸的點(diǎn)

樣量以每種氨基酸含5—20ug為宜，將準(zhǔn)備好的濾紙懸掛在點(diǎn)樣架上，濾紙垂直桌面，用點(diǎn)樣管吸取氨基酸樣品10ug，在濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣中心，這時樣品就自動流出。點(diǎn)樣的擴(kuò)散直徑控制在0.5cm之內(nèi)，點(diǎn)樣過程中必須在**滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。     

C、 將點(diǎn)好的樣品的濾紙倆側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處的紙的倆邊不要接

觸，避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿倆邊移動特別快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。  

D、 酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2，茚三酮2ml，溫度25*C，時間1h。注意：

使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。展層溶劑每張約需25ml。    

E、 顯色：待展層基本結(jié)束后，置65.C鼓風(fēng)箱中10—20min, 鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫

紅色黃色斑點(diǎn)。 

F、 Rf值的計算：用尺測量顯色斑點(diǎn)的中點(diǎn)與原點(diǎn)之間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，

求出此值，即得氨基酸的Rf值，計算出4種氨基酸在酸系統(tǒng)中的Rf值。  

  

三、實(shí)驗數(shù)據(jù)與分析