利用層析柱將混合物各組分分離開來的操作過程稱為柱層析。柱層析是層析技術(shù)中的一類，依據(jù)其作用原理又可分為吸附柱層析(原理見第97～100頁和第101～102頁)、分配柱層析(原理見第91～92及94～95頁)和離子交換柱層析等。其中以吸附柱層析應(yīng)用**廣。以下只介紹吸附柱層析的相關(guān)問題，其操作方法也可作為其他類型柱層析的參考。
1.吸附柱層析的器材 (1)層析柱
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實驗室中所用的玻璃層析柱有兩種形式：一是下部帶有活塞的玻璃管，如圖3-3**所示，活塞的芯**好是聚四氟乙烯制作的，這樣可以不涂真空油脂，以免污染產(chǎn)品。如果使用普通的玻璃活塞，則真空油脂要小心地涂薄涂勻。另一種是將玻璃管下端拉細(xì)，套上一段彈性良好的管子。這段管子必須是不能被淋洗劑溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因為橡皮易被氯仿、苯、THF等溶劑溶脹，而聚乙烯管子對大多數(shù)溶劑是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夾控制流速，如圖3-35b所示。此外，薄膜塑料柱如圖3-35c，因使用方便、節(jié)省淋洗劑、減少蒸發(fā)量等優(yōu)點，應(yīng)用日趨廣泛。薄膜塑料柱總是以扁平成卷保存的，兩側(cè)常有很深的折痕。使用前需將裁取的一段薄膜管一端扎緊，另一端套在一段玻璃管上并用棉線扎緊。將這段玻璃管穿過一個單孔塞。然后將薄膜管放進(jìn)一根又粗又長，下端拉細(xì)了的玻璃管內(nèi)，使塞子塞緊大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽氣，薄膜柱即因內(nèi)部壓強大于外部而自行展圓。待裝入吸附劑后在其下部扎幾個小孔即可使用。
層析柱的尺寸根據(jù)被分離物的量來確定，其直徑與高度之比則根據(jù)被分離混合物的分離難易而定，一般在1∶8到1∶50之間。柱身細(xì)長，分離效果好，但可分離的量小，且分離所需時間長；柱身短粗，分離效果較差，但一次可以分離較多的樣品，且所需時間短。如果待分離物各組分較難分離，宜選用細(xì)長的柱子，如果要處理大量的較易分離的或?qū)Ψ蛛x純度要求較低的混合物，則可選用粗而短的柱子。**常使用的層析柱，直徑與長度之比在1∶8 到1∶15 之間。
(2)吸附劑
柱層析中**常使用的吸附劑是氧化鋁或硅膠。其用量為被分離樣品的30～50倍，對于難以分離的混合物，吸附劑的用量可達(dá)100倍或更高。對于吸附劑應(yīng)綜合考慮其種類、酸堿性、粒度及活性等因素，**后用實驗方法選擇和確定。 市售氧化鋁有酸性、堿性和中性之分。酸性氧化鋁是用1%鹽酸浸泡后，用蒸餾水洗到其浸出液的pH值為4，適用于分離酸性物質(zhì)；堿性氧化鋁浸出液的pH值為9～10，用以分離胺類、生物堿及其他有機堿性化合物。中性氧化鋁的相應(yīng)pH值為7.5，適合于醛、酮、醌、酯等類化合物的分離以及對酸、堿敏感的其他類型化合物的分離。硅膠沒有酸堿性之分，可適用于各類有機物的分離。 柱層析所用氧化鋁的粒度一般為100～150目，硅膠為60～100目，如果顆粒太小，淋洗劑在其中流動太慢，甚**流不出來。
氧化鋁和硅膠的活性各分五個等級(見表2-5)。哪個活性級別分離效果**好，要用實驗方法確定，而不是盲目選擇高的活性級別，**常使用的是Ⅱ～Ⅲ級。如果吸附劑活性太低，分離效果不好，可通過“活化”來提高其活性。所謂“活化”就是指用加熱的方法除去吸附劑所含的水分，提高其吸附活性的過程。通常是將吸附劑裝在瓷盤里放進(jìn)烘箱中恒溫加熱。“活化”的溫度和時間應(yīng)根據(jù)分離需要而定。氧化鋁一般在200℃恒溫4h，硅膠在105～110℃恒溫0.5～1h。“活化”完畢，切斷電源，待溫度降**接近室溫時，從烘箱中取出放進(jìn)干燥器中備用。有的樣品在活性高的吸附劑中分離效果不好，可將吸附劑放在空氣中讓其吸收一些水分，分離效果反而好一些。
此外，一些天然產(chǎn)物帶有多種官能團(tuán)，對微弱的酸堿性都很敏感，則可用纖維素、淀粉或糖類作吸附劑。活性碳是一種吸附能力很高的吸附劑，但因粒度太小而不常用。
(3)淋洗劑
淋洗劑是將被分離物從吸附劑上洗脫下來所用的溶劑，所以也稱為洗脫劑或簡稱溶劑。其極性大小和對被分離物各組分的溶解度大小對于分離效果非常重要。如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)大于被分離物的極性，則淋洗劑將受到吸附劑的強烈吸附，從而將原來被吸附的待分離物“頂替”下來，隨多余的淋洗劑沖下而起不到分離作用；如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)小于各組分的極性，則各組分被吸附劑強烈吸附而留在固定相中，不能隨流動相向下移動，也不能達(dá)到分離的目的。如果淋洗劑對于被分離物各組分溶解度太大，被分離物將會過多、過快地溶解于其中并被迅速洗脫而不能很好地分離；如果溶解度太小，則會造成譜帶分散，甚**完全不能分開。常用溶劑的極性大小次序也因所用吸附劑的種類不同而不盡相同，第99～100頁給出了在硅膠和氧化鋁柱中常用溶劑所表現(xiàn)出的極性次序，可作為選擇溶劑的參考，shou先在薄層層析板上試選(見圖3-40)，初步確定后再上柱分離。如果所有色帶都行進(jìn)甚慢則應(yīng)改用極性較大溶解性能也較大的溶劑，反之則改用極性和溶解性都較小的溶劑，直**獲得滿意的分離效果。#p#分頁標(biāo)題#e#
除了分離效果外還應(yīng)當(dāng)考慮：①在常溫**沸點的溫度范圍內(nèi)可與被分離物長期共存不發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)，也不被吸附劑或被分離物催化而發(fā)生自身的化學(xué)反應(yīng)；②沸點較低以利回收；③毒性較小，操作安全；④適當(dāng)考慮價格是否合算，來源是否方便；⑤回收溶劑一般不應(yīng)作為**終純化產(chǎn)物的淋洗劑。
淋洗劑的用量往往較大，故**好使用單一溶劑以利回收。只有在選不出合適
的單一溶劑時才使用混合溶劑。混合溶劑一般由兩種可以無限混溶的溶劑組成，先以不同的配比在薄層板上試驗，選出**佳配比，再按該比例配制好，像單一溶劑一樣使用。如果必須在層析過程中改變淋洗劑的極性，不能把一種溶劑迅速換成另一種溶劑，而應(yīng)當(dāng)將極性稍大的溶劑按一定的百分率逐漸加到正在使用的溶劑中去，逐步提高其比例，直**所需要的配比。一條經(jīng)驗規(guī)律稱為“冪指數(shù)增加”，例如，原淋洗劑為環(huán)己烷，如欲加入二氯甲烷以增加其極性，則不應(yīng)立即換為二氯甲烷，而應(yīng)使用這兩種溶劑的混合液，其中二氯甲烷的比例依次為5%，15%，45%，**后再換為純凈的二氯甲烷。每次加大比例后，須待流出液量為吸附劑裝載體積的3倍時再進(jìn)一步加大比例。這只是一般方法，其目的在于避免后面的色帶行進(jìn)過快，追上前面的色帶，造成交叉帶。但如果兩色帶間有很寬闊的空白帶，不會造成交叉，則亦可直接換成后一種溶劑，所以應(yīng)根據(jù)具體情況靈活運用。
(4)被分離的混合物
在實際工作中，被分離的樣品是不能選擇的，但認(rèn)真考察各個組分的分子結(jié)構(gòu)，估計其吸附能力，對于正確選擇吸附劑和淋洗劑都是有益的。若化合物的極性較大，或含有極性較大的基團(tuán)，則易被吸附而較難被洗脫，宜選用吸附力較弱的吸附劑和極性較大的淋洗劑。反之，對于極性較小的樣品則選用極性較強的吸附劑和弱極性或非極性淋洗劑。若各組分極性差別較大，則易于分離，可選用較為短粗的柱子，使用較少的吸附劑；若各組分極性相差甚微，則難于分離，宜選用細(xì)長的柱子并使用較大量的吸附劑。
(5)其他物品
儲存淋洗劑的分液漏斗一只，接收洗出液的錐形瓶若干只，其容積大小根據(jù)淋洗劑的體積確定。玻璃毛少量，白沙少量，各自洗凈烘干。若層析柱很小，也可用少量脫脂棉代替玻璃毛。
2.吸附柱層析的操作 (1)裝柱
裝柱的方法分濕法和干法兩種。
濕法裝柱時，將柱豎直固定在鐵支架上，關(guān)閉活塞，加入選定的淋洗劑**柱容積的1/4 ，用一支干凈的玻璃棒將少量玻璃毛(或脫脂棉)輕輕推入柱底狹窄部位，小心擠出其中的氣泡，但不要壓得太緊密，否則淋洗劑將流出太慢或根本流不出來。將準(zhǔn)備好的白沙加入柱中，使在玻璃毛上均勻沉積成約5mm厚的一層。將需要量的吸附劑置燒杯中，加淋洗劑浸潤，溶脹并調(diào)成糊狀。打開柱下活塞調(diào)節(jié)流出速度為每秒鐘1滴，將調(diào)好的吸附劑在攪拌下自柱頂緩緩注入柱中，同時用套有橡皮管的玻璃棒輕輕敲擊柱身，使吸附劑在淋洗劑中均勻沉降，形成均勻緊密的吸附劑柱。吸附劑**好一次加完。若分?jǐn)?shù)次加，則會沉積為數(shù)層，各層交接處的吸附劑顆粒甚細(xì)，在分離時易被誤認(rèn)為是一個色層。全部吸附劑加完后，在吸附劑沉積面上蓋一層白沙(如柱很小，也可不用白沙而蓋上一張直徑與柱內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片)，關(guān)閉活塞。在全部裝柱過程及裝完柱后，都需始終保持吸附劑上面有一段液柱，否則將會有空氣進(jìn)入吸附劑，在其中形成氣泡而影響分離效果。如果發(fā)現(xiàn)柱中已經(jīng)形成了氣泡，應(yīng)設(shè)法排除，若不能排除，則應(yīng)倒出重裝。裝好的吸附柱各層材料的分布見圖3-36。
干法裝柱時，先將柱豎直固定在鐵支架上，關(guān)閉活塞。加入溶劑**柱容積的3/4，打開活塞控制溶劑流速為1滴/秒，然后將所需量的吸附劑通過一支短頸玻璃漏斗慢慢加入柱中，同時，輕輕敲柱身使柱填充緊密。干法裝柱的缺點是容易使柱中混有氣泡。特別是使用硅膠為吸附劑時，**好不用干法裝柱，因為硅膠在溶劑中有一溶脹過程，若采用干法裝柱，硅膠會在柱中溶脹，往往留下縫隙和氣泡，影響分離效果，甚**需要重新裝柱。 裝填薄膜塑料柱時，可先按圖3-35c所示的那樣用抽氣法將薄膜展開成圓柱形，在底部裝入一段玻璃毛，吸附劑通過一個粗頸漏斗自柱頂裝入。裝**1/3處，將柱身在堅硬的表面上礅結(jié)實，再裝入1/3，再礅結(jié)實，直**裝到需要的高度。裝成的薄膜柱應(yīng)緊密結(jié)實，可以像玻璃柱那樣用夾子夾住，再在其底部扎一些小孔即可使用。(2)加樣
加樣亦有干法、濕法兩種。濕法加樣是將待分離物溶于盡可能少的溶劑中，如有不溶性雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)濾去。打開柱下活塞小心放出柱中液體**液面下降到濾紙片處，關(guān)閉活塞，將配好的溶液沿著柱內(nèi)壁緩緩加入，切記勿沖動吸附劑，否則將造成吸附劑表面不平而影響分離效果。溶液加完后，小心開啟柱下活塞，放出液體**溶液液面降**濾紙片時，關(guān)閉活塞，用少許溶劑沖洗柱內(nèi)壁(同樣不可沖動吸附劑)，再放出液體**液面降到濾紙?zhí)帲俅螞_洗柱內(nèi)壁，直**柱壁和柱頂溶劑沒有顏色。加樣操作的關(guān)鍵是要避免樣品溶液被沖稀。在技術(shù)熟練的情況下，也可以不關(guān)下部活塞，在每秒鐘1滴的恒定流速下連貫地完成上述操作。 干法加樣是將待分離樣品加少量低沸點溶劑溶解，再加入約5倍量吸附劑，拌和均勻后在通風(fēng)櫥中蒸發(fā)**干。揭去柱頂濾紙片，將吸附了樣品的吸附劑平攤在柱內(nèi)吸附劑的頂端，在上面加蓋濾紙片或加蓋一層白沙。干法加樣易于掌握，不會造成樣品溶液的沖稀，但不適合對熱敏感的化合物。 #p#分頁標(biāo)題#e#
(3)淋洗和接收
樣品加入后即可用大量淋洗劑淋洗。隨著流動相向下移動，混合物逐漸分成若干個不同的色帶，繼續(xù)淋洗，各色帶間距離拉開，**終被一個個淋洗下來。當(dāng)**色帶開始流出時，更換接收瓶，接收完畢再更換接受瓶，接受兩色帶間的空白帶，并依此法分別接收各個色帶。若后面的色帶下行太慢，可依次使用幾種極性逐漸增大的淋洗劑來淋洗。為了減少添加淋洗劑的次數(shù)，可用分液漏斗在柱頂“自動”添加，如圖3-36所示。分液漏斗的活塞打開，頂塞密封，尾部插進(jìn)柱上部的淋洗劑液面以下，當(dāng)液面下降后，漏斗尾部露出，即有空氣泡自尾部進(jìn)入分液漏斗，這就加大了漏斗內(nèi)液面上的壓力，漏斗內(nèi)的淋洗劑就自動流入柱內(nèi)，使柱內(nèi)液面上升，當(dāng)液面淹沒漏斗尾部時，就不再有空氣進(jìn)入漏斗，漏斗內(nèi)的淋洗劑就不再流出。在使用薄膜塑料柱進(jìn)行層析時，一旦色帶形成并拉開距離，可將柱吸干，用刀沿“空白帶”處切開，將各色帶分別萃取，各自蒸去溶劑，即得到相應(yīng)組分的化合物。
(4)顯色
分離無色物質(zhì)時需要顯色。如果使用帶螢光的吸附劑，可在黑暗的環(huán)境中用紫外光照射以顯出各色帶的位置，以便按色帶分別接收。但柱上顯色遠(yuǎn)不如在薄層板上顯色方便。所以常用的辦法是等分接收，即事先準(zhǔn)備十幾個甚**幾十個接收瓶，依次編出號碼，各接收相同體積的流出液，并各自在薄層板上點樣展開，然后在薄層板上顯色(相關(guān)的顯色操作見薄層層析部分)。具有相同Rｆ值的為同一組分，可以合并處理。也可能出現(xiàn)交叉帶，若交叉帶很少，可以棄之，若交叉帶較多，或樣品很貴重，可以將交叉部分再次作柱層析分離，直**完全分開。例如，某一樣品經(jīng)等分接收和薄層層析并顯色處理后如圖3-37所示。由圖可知，1，7，8號 接收液都是空白，沒有任何組分，可以合并。2～6號為**組分，可以合并處理，9～13號為第二組分，14～16號為第三組分，17～20號為第四組分。其中第14號實際是一個交叉帶，以第三組分為主，也含有少量第二組分。如果對第三組分的純度要求不高，可以并入第三組分；如果對第三組分的純度要求甚高，可將第14號接收液濃縮后再做一次柱層析分離。
3.柱層析操作中應(yīng)注意的問題
(1)要控制淋洗劑流出的速度。一般控制流速為1滴/秒。若流速太快，樣品在柱中的吸附和溶解過程來不及達(dá)到平衡，影響分離效果。若流速太慢，分離時間會拖得太長。有時，樣品在柱中停留時間過長，可能促成某些成分發(fā)生變化。或流動相在柱中下行速度小于樣品的擴散速度，會造成色帶加寬、交合甚**根本不能分離。
(2)以下現(xiàn)象會嚴(yán)重影響分離效果，必須盡力避免。
a.色帶過寬，界限不清。造成的原因可能是柱的直徑與高度比選擇不當(dāng)，或吸附劑、淋洗劑選擇不當(dāng)，或樣品在柱中停留時間過長。但更常見的卻是在加樣時造成的。若在樣品溶液加進(jìn)柱中后，沒有打開下部活塞放出淋洗劑使樣品溶液降**濾紙片處，即急于加溶劑沖洗柱壁，造成樣品溶液大幅度稀釋，或過早加大量溶劑淋洗，必然會造成色帶過寬。所以溶樣時一定要使用盡可能少的溶劑，加樣時一定要避免樣品溶液的稀釋。
b.色帶傾斜。正常情況下柱中的色帶應(yīng)是水平的，如圖3-38a 所示。而傾斜的色帶如圖3-38b所示，在前一個色帶尚未完全流出時，后面色帶的前沿已開始流出，所以不能接收到純粹的單一組分。造成色帶傾斜的原因是吸附劑的頂面裝得傾斜，或柱身安裝得不垂直。
c.氣泡。造成氣泡的原因可能是玻璃毛或脫脂棉中的空氣未擠凈，其后升入吸附劑中形成氣泡，也可能是吸附劑未充分浸潤溶脹，在柱中與淋洗劑作用發(fā)熱而形成，但更大量的是在裝柱或淋洗過程中淋洗劑放出過快，液面下降到吸附劑沉積面之下，使空氣進(jìn)入吸附劑內(nèi)部滯留而成。當(dāng)柱內(nèi)有氣泡時，大量淋洗劑順氣泡外壁流下，在氣泡下方形成溝流，使后一色帶前沿的一部分突出伸入前一色帶(見圖3-38c)，從而使兩色帶難于分離。所以在裝柱及淋洗過程中應(yīng)始終保持吸附劑上面有一段液柱。
d.柱頂面填裝不平。這時色帶前沿將沿低凹處向下延伸進(jìn)入前面的色帶(見圖3-38d)，這也是一種溝流。
e.斷層和裂縫。當(dāng)柱內(nèi)某一區(qū)域內(nèi)積有較多氣泡時，這些氣泡會合并起來在柱內(nèi)形成斷層或裂縫。圖3-38e表示了裂縫造成的溝流，而斷層相當(dāng)于一個不平整的裝載面，它造成溝流的情況與圖38d相似。
